Forschung in Genen und Proteinen Offener Zugang

Abstrakt

Antikörper gegen MyoD verringern das organische Myogenin-Phänomen und die Agrin-induzierte Neurotransmitter-Rezeptor-Verklumpung

 Erica E. Anderson1, David H. Campbell2, Kelly Ezell1, Paul R. Standley2 und Wade A. Grow1

Eine Familie myogener restriktiver Faktoren sowie MyoD und Myogenin steuern die Myogenese und die Bildung von Kontraktorverbindungen. Die biologische Aktivität von Myogenin wird durch MyoD aktiviert, und eine der Funktionen von Myogenin besteht darin, die biologische Aktivität des Neurotransmitterrezeptors (AChR) an der Kontraktorverbindung zu aktivieren. Motorneuronen setzen Agrin frei, wenn sie sich während der Entwicklung Muskelfasern nähern, was die Ansammlung vorhandener AChRs an den Ort der Bildung von Kontraktorverbindungen treibt. Wir haben bereits zuvor festgestellt, dass eine kontinuierliche Proteinexposition gegenüber MyoD oder Myogenin die durch Agrin induzierte AChR-Ansammlung in C2C12-Muskelzellkulturen verringert. Unser Ziel war es, genauer festzustellen, wie sich MyoD und Myogenin während der Entwicklung bewegen. Methoden: C2C12-Zellkulturen wurden experimentellen Manipulationen sowie Antikörpern gegen MyoD und Myogenin sowie Myogenin-Morpholino ausgesetzt. Endo-Porter wurde verwendet, um die Zellaufnahme experimenteller Manipulationen zu erhöhen. AChR-Verklumpungstests wurden durchgeführt, um die Wirkung von Protein oder Morpholino auf Agrin-induzierte AChR-Verklumpungen zu bewerten. Western Blots zeigen Myogenin-Biosynthese bei Protein- oder Morpholino-Exposition. Ergebnisse: Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass eine nur achtstündige Exposition von Protein gegenüber Myogenin die Agrin-induzierte AChR-Verklumpung in Myotuben verringert. Wir haben bereits zuvor bewiesen, dass einige experimentelle Manipulationen die Myogenin-Biosynthese verringern und gleichzeitig die Agrin-induzierte AChR-Verklumpung verringern. Diese Ergebnisse beweisen deutlich, wie MyoD und Myogenin bei der Bildung von Kontraktorverbindungen eine Rolle spielen, indem sie zeigen, dass die Exposition von Protein gegenüber MyoD die Myogenin-Biosynthese verringert und gleichzeitig die Agrin-induzierte AChR-Verklumpung verringert. Schlussfolgerung: Diese Ergebnisse legen nahe, dass MyoD für Agrin-induzierte AChR-Verklumpungen durch einen Mechanismus von entscheidender Bedeutung ist, der die Aktivierung des Myogenin-Bioprozesses beinhaltet, was zur Aktivierung des AChR-Bioprozesses und schließlich zur Produktion eines geeigneten AChR-Spiegels für Agrin-induzierte AChR-Verklumpungen und die Bildung von Kontraktorverbindungen führt. AChRs wurden durch die Bindung von α-Bungarotoxin, konjugiert mit Tetramethylrhodamin (Molecular Probes), markiert. Die Kulturen wurden in dem toxinhaltigen Medium 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um AChRs nach 72 Stunden in DM zu markieren. Die Deckgläser wurden dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gespült, 10 Minuten lang mit 2 Paraformaldehyden in PBS fixiert, dreimal mit PBS gespült, 5 Minuten lang bei -20 °C in kaltem Holzalkohol dehydriert und auf Objektträgern mit Vergrößerungsglas in Vectashield Mounting Medium für sichtbares Licht (Vector Laboratories) fixiert. AChR-Cluster wurden mit der umgekehrten Lupe IX70 Olimbos unter dem 20-fachen Objektiv visualisiert (was eine vollständige Vergrößerung von 200-fach ergibt), und Fluoreszenzbilder wurden als hochauflösende JPG-Dateien mit einer Olimbos-Kamera mit dem digitalen Bildgebungspaket Magnafire aufgenommen.In Fluoreszenzbildern wurden auf allen Seiten der Myotuben helle Cluster von AChRs gefunden. Jedes Graustufenbild wurde mithilfe des Objektidentifizierungsalgorithmus von Cell Profiler analysiert. Der im Algorithm verwendete Rand wurde als die minimale Fluoreszenzintensität definiert, die ein Pel aufweisen muss, um als Teil eines Clusters gezählt zu werden. Experimente mit dem Rand zeigten, dass eine minimale Helligkeit von 70 % ein Pel mit ausreichend sichtbarem Licht definierte, um als Teil eines Clusters gezählt zu werden, und dieser Schwellenwert wurde für alle Analysen verwendet. Um eine sichere Beurteilung und konsistente Quantifizierung zu gewährleisten, waren der Rand und alle anderen Einstellungen in allen Gruppen und Bildern konstant. Modelle der Sequenzaktivierung während der Myogenese sagen voraus, dass Gene nacheinander aktiviert werden, beginnend mit der Aktivierung von Myogenin durch MyoD. Der erste Entwurf für die myogene Differenzierung kombinierte die genomweite Transkriptionsfaktorbindung und Expressionsidentifizierung, um das myogene Differenzierungsprogramm in Zellmuskelzellen besser zu erklären. Myogene restriktive Faktoren steuern die Myogenese sowie die Bildung der Kontraktorverbindung. Insbesondere zeigte die erste Studie, dass MyoD in wachsenden Myoblasten auf Gene abzielte, die an der Spezifikation und Konfiguration von Verbindungen beteiligt sind.
Schlüsselwörter: AChR; Agrin, C2C12; Sequenzausdruck; MyoD; Myogenin; Kontraktorverbindung.