Zeitschrift für HIV und Retroviren Offener Zugang

Abstrakt

Erstellung eines virulenten vollständigen cDNA-Klons für das Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV)

Zhu Longchao

Ein infektiöser MERS-CoV-Klon ist eine wichtige Plattform zur Untersuchung der Virusproteinfunktion und der Virus-Wirt-Interaktion. In der vorliegenden Studie wurde der infektiöse cDNA-Klon des an Vero-Zellen adaptierten MERS-CoV (MERS-CoV-HKU) mit der nahtlosen Klontechnologie auf Basis der Restriktionsstelle BsmBI der Klasse II erzeugt. Sein Genom wurde in 12 zusammenhängende Fragmente aufgeteilt und nach Amplifikation mittels PCR mit BsmBI flankiert. Die Fragmente wurden mithilfe einzigartiger Verbindungen, die durch Verdauung der Endonuklease BsmBI in zwei Klonierungsrunden entstanden, weiter zu künstlichen Bakterienchromosomen (BAC) zusammengesetzt. Zwei BsmBI-Restriktionsstellen innerhalb des Genoms wurden durch stille Mutation entfernt und als molekularer Marker für icMERS-CoV-HKU festgelegt. Schließlich wurde ein MERS-CoV-HKU in voller Länge stromabwärts des CMV-Promoters in BAC wiederhergestellt.

Im Vergleich zum Wildtyp HCoV-EMC/2012 zeigte das durch infektiöse Klone gewonnene MERS-CoV-HKU hohe Titer auf Vero- und Huh7-Zellen. Durch genetische Analyse wurden genetische Veränderungen an nichtstrukturellen Proteinen (nsp2, nsp3, nsp14 und nsp16) und strukturellen Proteinen (Spike, ORF5 und N) festgestellt. Die synonymen Mutationen wurden in nsp2 (A2169C), nsp3 (C6172T, A6954G), nsp14 (C19514T), nsp16 (T21423G), S (A22367G, T24093A) und N (T29149A) platziert. Nicht-synonyme Mutationen wurden in nsp3 (C6172T, A6954G), S (C25217T) und N (A29574T) gefunden, was zu Aminosäuremutationen in nsp3 (T198I, D1702Y), S (S1251F) und N (S192T) führt. Überraschenderweise wurden in den Regionen S2 und ORF5 jeweils drei Aminosäuren-Insertionen „SHY“ und vier Nukleotide „TTTA“-Deletionen gefunden.

Laut der vorherigen Studie kann die RBD von BatCoV-HKU4 und BatCoV-HKU25 den menschlichen DPP4-Rezeptor erkennen, die RBD von BatCoV-HKU5 hingegen nicht. Um die Beziehung zwischen MERS-CoV und BatCoVs aufzuklären, wurden der MERS-CoV-infektiöse Klon und chimäre MERS-CoV-infektiöse Klone erzeugt, in denen die MERS-RBD-Region durch die von BatCoV-HKU4, BatCoV-HKU5 und BatCoV-HKU25 ersetzt wurde. Rekombinante MERS-CoV-infektiöse Klone wurden weiter auf ihre Replikation auf den Zelllinien Vero und Huh7 untersucht.

Unser rekombinanter infektiöser MERS-CoV-Klon hat seine entscheidende Rolle bei der Erforschung der Übertragung und Pathogenese des Coronavirus zwischen Arten gezeigt.