Forschung in Genen und Proteinen Offener Zugang

Abstrakt

Neuartige Anwendung der Cucurbita maxima Schalenprotease in Waschmitteln

Vadivukkarasi S, Manikandan M Pavithra K und Vasudevan M

Das Proteaseenzym aus der Schale von Cucurbita maxima wurde isoliert und gereinigt und seine Anwendung zum Entfernen von Blutflecken untersucht. Der optimale pH-Wert und die optimale Temperatur für diese neu isolierte Protease lagen bei 7,0 bzw. 40 °C. Das Molekulargewicht der isolierten Protease wurde per SDS-PAGE ermittelt und betrug 31 kD. Dieses neue Proteaseenzym wurde auf blutbefleckte Kleidung aufgetragen, um die Fleckenentfernungskapazität des Enzyms in Anwesenheit und Abwesenheit von Reinigungsmitteln zu beurteilen. Die Ergebnisse bestätigen, dass die neu isolierte Protease Flecken mit und sogar ohne Reinigungsmittel vollständig entfernt. Diese Studie bestätigt die Anwendung der Protease aus der Schale von Cucurbita maxima zum Entfernen von Blutflecken.
Der thermostabile proteolytische Rohextrakt und die gereinigte Protease von Aspergillus tamarii URM4634 wurden bei verschiedenen Temperaturen untersucht. Die Aktivitätsergebnisse wurden verwendet, um die Aktivierungsenergie der durch Rohextrakt und gereinigte Protease katalysierten Hydrolysereaktion (E* = 34,2 und 16,2 kJ/mol) sowie die jeweiligen Standardenthalpievariationen der reversiblen Enzymentfaltung (ΔH°u = 31,9 und 13,9 kJ/mol) abzuschätzen. Bei Temperaturerhöhung von 50 auf 80 °C in Restaktivitätstests stieg die spezifische Geschwindigkeitskonstante der Thermoinaktivierung des proteolytischen Rohextrakts von 0,0072 auf 0,0378 min−1, während die der gereinigten Protease von 0,0099 auf 0,0235 min−1 stieg. Diese Werte, die einer Halbwertszeitverkürzung von 96,3 auf 18,3 min bzw. von 70,0 auf 29,5 min entsprechen, ermöglichten uns die Abschätzung der Aktivierungsenergie (E*d = 49,7 und 28,8 kJ/mol), Enthalpie (ΔH*d = 47,0 und 26,1 kJ/mol), Entropie (ΔS*d = −141,3 und −203,1 J/mol K) und Gibbs-Freienergie (92,6 ≤ ΔG*d ≤ 96,6 kJ/mol und 91,8 ≤ ΔG*d ≤ 98,0 kJ/mol) der Thermoinaktivierung. Solche Werte lassen darauf schließen, dass diese Protease, die sich in beiden Formen als hochgradig thermostabil erwies, gewinnbringend in industriellen Anwendungen eingesetzt werden könnte. Nach unserem besten Wissen ist dies die erste vergleichende Studie zu thermodynamischen Parametern einer von Aspergillus tamarii URM4634 produzierten Serinprotease.
Proteasen, die auch als „Verdauungsenzyme“ bezeichnet werden, sind bekannte Biokatalysatoren. Sie werden kommerziell in verschiedenen Branchen wie Waschmittel, Lebensmittel, Pharma, Diagnostik usw. eingesetzt. Berichten zufolge werden 60 % des gesamten Enzymmarktes von Proteasen abgedeckt, die als das wertvollste kommerzielle Enzym gelten. Die Quelle der Proteasen ist enorm, und bakterielle Proteasen sind im Vergleich zu pflanzlichen und tierischen Proteasen bedeutender, da sie schnell wachsen und leicht genetisch manipuliert werden können. Pflanzliche Proteasen, die eine einzigartige Substratspezifität aufweisen, sind jedoch frei von unerwünschten Nebenenzymaktivitäten, die in mikrobiellen oder tierischen Systemen fehlen. Dies macht die pflanzlichen proteolytischen Enzymressourcen zu einer wertvollen Quelle mit umfassenden Anwendungsmöglichkeiten in der Enzymindustrie. Es gibt nur wenige Berichte über die Charakterisierung pflanzlicher Proteasen.
Daher wird die mühsame Suche nach neuen potenziellen pflanzlichen Proteasen fortgesetzt, um sie industriell anwendbar und kostengünstig zu machen. Für die vorliegende Untersuchung wurde die Pflanze Citrus decumana L. (Familie Rutaceae) ausgewählt, da über das Enzym Protease und seine Charakterisierung kein Bericht vorliegt. Die medizinische Verwendung der ausgewählten Pflanze ist gut dokumentiert: krampflösend, entzündungshemmend, blutungsstillend, bronchodilatatorisch, antidiabetisch, anthelminthisch.
Diese Arbeit wurde teilweise auf der 10. Internationalen Konferenz für Genomik und Molekularbiologie vom 21. bis 23. Mai 2018 in Barcelona, ​​Spanien, vorgestellt.
Erweiterte Zusammenfassung,
Bd. 1, Ausg. 1
2019,
Forschung zu Genen und Proteinen,
Desinfektionsmittel usw. Daher schien die Pflanze ein vielversprechender Kandidat als Proteasequelle zu sein, die für biotechnologische Anwendungen genutzt werden kann. Ziel der vorliegenden Studie ist es daher, die Protease zu charakterisieren und sie aus den Blättern von Citrus decumana L. teilweise zu reinigen, damit diese proteolytischen Enzyme als alternative Quelle kommerzialisiert werden können.
Alkalische Protease aus alkaliphilem Bacillus sp. NPST-AK15 wurde durch physikalische Adsorption und kovalente Bindung auf funktionalisierten und nicht funktionalisierten rasselartigen magnetischen Kern@mesoporen Schale Silica (RT-MCMSS) Nanopartikeln immobilisiert. Der Ansatz der kovalenten Bindung war jedoch für die Immobilisierung der NPST-AK15-Protease auf den aktivierten RT-MCMSS-NH-Nanopartikeln überlegen und wurde für weitere Studien verwendet. Im Vergleich zur freien Protease zeigte das immobilisierte Enzym eine Verschiebung der optimalen Temperatur und des pH-Werts von 60 auf 65 °C bzw. von pH 10,5-11,0. Während die freie Protease nach einer Behandlung von 1 h bei 60 °C vollständig inaktiviert wurde, behielt das immobilisierte Enzym unter ähnlichen Bedingungen 66,5 % seiner ursprünglichen Aktivität. Die immobilisierte Protease zeigte einen um das 1,3- bzw. 1,2-fache höheren k cat und K m als das lösliche Enzym. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse eine signifikante Verbesserung der Stabilität der NPST-AK15-Protease in verschiedenen organischen Lösungsmitteln, Tensiden und handelsüblichen Waschmitteln nach Immobilisierung auf aktivierten RT-MCMSS-NH-Nanopartikeln. Wichtig ist, dass die immobilisierte Protease zehn aufeinanderfolgende Reaktionszyklen lang eine signifikante katalytische Effizienz beibehielt und mithilfe eines externen Magnetfelds problemlos vom Reaktionsgemisch getrennt werden konnte. Nach bestem Wissen ist dies der erste Bericht über die Immobilisierung von Proteasen auf rasselartigen magnetischen Kern@mesoporösen Hüllen-Silica-Nanopartikeln, bei dem auch der Kompromiss zwischen Aktivität und Stabilität nicht bestand. Die Ergebnisse weisen eindeutig darauf hin, dass das entwickelte immobilisierte Enzymsystem ein vielversprechender Nanobiokatalysator für verschiedene Bioprozessanwendungen ist, die eine Protease erfordern.