American Journal of Drug Delivery and Therapeutics Offener Zugang

Abstrakt

Expression von Urease B aus dem iranischen Helicobacter pylori in Apoplast-Tabak

Tabrizi Maleki

1. Hintergrund

Helicobacter pylori ist ein gramnegatives Bakterium, das erstmals von Marshall und Warren aus der Magenschleimhaut von Patienten mit Gastritis und Magengeschwüren isoliert wurde. Helicobacter pylori ist die Hauptursache für chronische Infektionen der Magenschleimhaut und betrifft 50 % der Weltbevölkerung. Kürzlich wurde gezeigt, dass H. pylori andere Komplikationen wie Magengeschwüre, Zwölffingerdarmentzündungen und Gastritis verursacht. Laut der Literatur entwickelt ein beträchtlicher Anteil der mit H. pylori infizierten Patienten möglicherweise keine Magen-Darm-Erkrankungen und kann über einen langen Zeitraum asymptomatisch bleiben. Andererseits erhöhen langfristige Infektionen das Risiko von Erkrankungen wie Adenokarzinom und Magenlymphom.

Mehrere Studien haben bestätigt, dass H. pylori ein äußerst krebserregender Erreger ist. Die Sterblichkeitsrate im Zusammenhang mit einer Infektion mit Helicobacter pylori wird auf 1 Fall pro 34 infizierte Männer und 1 Fall pro 60 infizierte Frauen geschätzt. Helicobacter pylori produziert große Mengen Urease (10 % - 15 % des gesamten Proteingewichts), die für das Überleben und die Pathogenese von H. pylori erforderlich sind. Viele Enzyme reduzieren den Säuregehalt der unmittelbaren Umgebung von H. pylori, indem sie Ammoniak und Karbonat aus Harnstoff produzieren. Helicobacter pylori-Urease ist ein multimeres Enzym mit einem Molekulargewicht von 550 kDa, das aus zwei separaten Untereinheiten von UreA (29,5 kDa) und UreB (66 kDa) gewonnen wird. In jüngster Zeit haben sich Forscher mit der Entwicklung von Impfstoffen gegen H. pylori-Infektionen beschäftigt. Unter den verschiedenen Kandidatenantigenen gilt UreB als das wirksamste, da die Immunisierung von Mäusen mit gereinigtem UreB im Gegensatz zu Harnstoff zu einer höheren Immunogenität und einem höheren Schutz führt. Die Auswahl von Urease als Immunisierungsziel basiert auf der Tatsache, dass Membranproteine ​​häufig eine Immunreaktion auslösen.

In dieser Studie verwendeten wir ein leistungsstarkes Vorhersage-Softwareprogramm für die Epitopkartierung. Anhand mehrerer spezifischer Epitope von B-Lymphozyten, die nebeneinander lagen, wählte dieses Programm das Aminosäurefragment des UreB-Gens aus. Darüber hinaus wurde das antigene Fragment als rekombinantes Protein des Stammes Escherichia coli BL21(DE3) exprimiert und gereinigt. Ziel dieser Studie war es, unter Verwendung relevanter Softwareprogramme ein Fragment des rekombinanten UreB (rUreB) mit signifikanten antigenen Eigenschaften zu präsentieren.

2. Ziele

Ziel dieser Studie war es, einen rekombinanten Vektor bereitzustellen, der aus der antigenen Region von UreB von H. pylori besteht, wobei die immundominanten Epitope des Antigens anstelle der Gesamtsequenz und Expression in E. coli verwendet wurden. Außerdem wollten wir seine Antigenität als Impfstoffkandidat bestimmen und seine Wirksamkeit bei der serologischen Diagnose einer H. pylori-Infektion beim Menschen beurteilen.

3. Methoden

3.1. Herstellung von Bakterien, Plasmiden und anderen Reagenzien

In dieser Studie wurde H. pylori aus der Biopsie von dyspeptischen Patienten kultiviert, die einer routinemäßigen diagnostischen Endoskopie unterzogen wurden. Vor der Biopsie wurde von allen Patienten die Einwilligung zur Teilnahme an der Studie eingeholt. Die Kulturbedingungen wurden auf Grundlage der Ergebnisse früherer Berichte festgelegt. Die isolierten Biopsieproben wurden auf Brucella-Agar (Merck, Deutschland) kultiviert, der Trimethoprim (5 µg/ml), Vancomycin (10 µg/ml) und Amphotericin B (2,5 µg/ml) enthielt, ergänzt mit 5 % Schafblut.

Nach Inkubation unter mikroaerophilen Bedingungen für 3 - 5 Tage bei 37 °C (CO2: 10 %) wurden die gewachsenen Bakterien durch routinemäßige mikrobiologische Tests, einschließlich Gram-Färbung sowie Oxidase-, Urease- und Katalasetests, als H. pylori identifiziert. Zur weiteren Auswertung verwendeten wir die Vektoren pET-32a und pBSK (Novagen Inc., USA). Darüber hinaus wurde der Vektor pET-32a verwendet, um Fusionsproteine ​​mit einem 6-Histidin-Tag und einem N-terminalen T7-Epitop-Tag herzustellen. Diese zusätzlichen Aminosäuren erhöhten das Gewicht des hergestellten Proteins um bis zu 20 kDa. In dieser Studie wurden Restriktionsenzyme und DNA-Ligase von Fermentas (Litauen) bezogen, und der Stamm E. coli DH5α (Stratagene, USA) wurde für das erste Klonen verwendet. Zusätzlich wurde rekombinantes pET-32a (pET-32a UreB) in E. coli BL21(DE3)pLysS (Novagen, USA) als Wirtsbakterienstamm transformiert. Für die routinemäßige Bakterienkultur verwendeten wir die Lysogeny-Brühe (Luria-Bertani-Brühe, LB; Sigma, USA). Die erforderlichen Antibiotika, darunter Ampicillin (100 µg/mL) und Chloramphenicol (34 µg/mL; Sigma, USA), wurden dem LB-Medium hinzugefügt (10). Die Chemikalien wurden von Merck (Deutschland) bezogen und die Enzyme von Fermentas (Litauen) und SinaClon Co.

Ergebnisse: Die Sequenzierungsergebnisse der PCR deuteten auf eine Klonierung des UreB-Gens in das rekombinante Plasmid hin. Die Produktion des Proteins wurde durch Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und das exprimierte Protein wurde mittels Dialyse unter Verwendung des Ni-NTA-Kits gereinigt. Darüber hinaus wurde das rekombinante Protein mit einem Molekulargewicht von 42 kDa im Western Blot von Antikörpern erkannt.

Schlussfolgerung: Die Auswertung der Antikörper wies auf hohe antigene Eigenschaften des immunogenen Fragments hin, wie sie durch immunologische Bioinformatik vorhergesagt wurden. Daher könnte das rekombinante Protein UreB ein geeignetes Antigen für die Entwicklung von Impfstoffen gegen H. pylori und anderen Diagnosekits sein.